Cromatografía líquida
La cromatografía es una de las herramientas más potentes en química analítica y es uno de los instrumentos más comunes en el laboratorio. En esta técnica, la fase móvil es un líquido.
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
La cromatografía líquida de alta presión, ahora conocida como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), es una técnica cromatográfica utilizada para identificar, cuantificar, separar y purificar los distintos compuestos presentes en una mezcla [1].
¿Cómo funciona la cromatografía líquida de alto rendimiento?
En la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la muestra de mezcla se hace pasar junto con un disolvente líquido a alta presión a través de una columna llena de un material adsorbente sólido. La presión en el sistema se eleva con la ayuda de bombas. El principio de funcionamiento es que cada compuesto en la mezcla interactúa de manera ligeramente diferente con el material adsorbente en la columna, lo que produce velocidades de flujo variables para los distintos componentes. Esto conduce a la separación de los componentes a medida que salen de la columna. El material adsorbente utilizado suele ser granular, compuesto de partículas sólidas, como sílice, que forman la “fase estacionaria”. El líquido a presión es una mezcla de disolventes, como agua, y líquidos orgánicos, como metanol y acetonitrilo, que forman la “fase móvil”.
El detector está conectado a un microprocesador digital y a un software de usuario para la adquisición y el análisis de datos. Los compuestos separados se visualizan como picos con el número de picos correspondiente al número de componentes separados en la mezcla. La superficie del pico es proporcional a la concentración del compuesto presente en la mezcla [2]. La resolución entre dos picos en las técnicas cromatográficas es el grado en que las sustancias se separan durante el experimento. Una resolución más alta refleja una buena separación de los compuestos.
¿Para qué se utiliza la cromatografía líquida de alto rendimiento?
La cromatografía líquida de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones en los campos de la bioquímica, química analítica, productos farmacéuticos, ciencia forense, investigación alimentaria y otras áreas. Por ejemplo, la HPLC también se utiliza en las pruebas de sustancias prohibidas en atletas.
¿Por qué utilizar la cromatografía líquida de alto rendimiento?
La HPLC es asequible y versátil. Ofrece ventajas útiles, como la gestión de datos y la validación de instrumentos.
Cromatografía líquida de rendimiento ultraalto (UHPLC)
La cromatografía líquida de rendimiento ultraalto (UHPLC) es una variante de la HPLC que utiliza partículas más pequeñas para mejorar el rendimiento cromatográfico y requiere presiones más altas. Como sucede con la HPLC, los contaminantes del agua pueden tener un impacto negativo en los resultados; sin embargo, debido a las mayores sensibilidades de la UHPLC, el efecto puede ser más extremo.
Tanto la HPLC como la UHPLC pueden utilizarse para la cromatografía líquida, pero el equipo necesario para realizar cada técnica es diferente y cada una tiene ventajas diferentes. La menor longitud de columna supone que la cromatografía líquida de rendimiento ultraalto proporciona una resolución superior que la HPLC tradicional.
Cromatografía iónica
La cromatografía iónica permite la separación de iones y moléculas polares en función de su interacción con una columna de medios de intercambio iónico. Se puede utilizar para casi cualquier tipo de molécula cargada, incluidas proteínas grandes, nucleótidos pequeños y aminoácidos. Se utiliza mucho para la determinación de cationes y aniones inorgánicos y orgánicos.
La calidad del agua usada como reactivo afecta a casi todos los aspectos del análisis HPLC, desde la preparación de muestras y estándares hasta el enjuague y elución de las columnas. Esto convierte al agua en el reactivo más consumido en HPLC.
Normalmente se utiliza agua pura (de tipo II) para preparar blancos, estándares, eluyentes y para el pretratamiento de muestras; sin embargo, como la HPLC de gradiente ofrece límites de detección extremadamente bajos, los requisitos del agua son más estrictos y se requiere la máxima calidad.
Gran parte de los problemas de rendimiento de HPLC se deben a la mala calidad del agua utilizada en la preparación de eluyentes, estándares y muestras de HPLC. El agua de mala calidad o contaminada afecta a la resolución al introducir picos fantasmas, alterar la selectividad de la fase estacionaria y afectar a las líneas de referencia durante la separación cromatográfica.
Además, puede provocar la acumulación de contaminantes en la fase estacionaria, lo que puede causar la obstrucción de la columna. Esto produce un aumento de la presión y un cambio en el tiempo de ejecución de la muestra. Los datos de mala calidad, como los cambios en los tiempos de retención, la pérdida de resolución o los picos fantasma, podrían ser una indicación de contaminación causada por sustancias orgánicas, iones, bacterias o partículas.
¿Cuáles son los diferentes tipos de contaminantes en el agua que afectan a los resultados de HPLC?
1. Compuestos orgánicos
La contaminación por compuestos orgánicos del agua ultrapura puede afectar a la separación cromatográfica de diferentes maneras:
(i) Reducción de la vida útil de la columna: las moléculas orgánicas que se vinculan a la superficie de la columna pueden ralentizar el acceso de las moléculas de muestra y solvente a los sitios de vinculación en las perlas de la columna (fase estacionaria). Esto produce una disminución de la capacidad de la columna para separar compuestos o pérdida de resolución y una menor vida útil de la columna.
(ii) Reducción de sensibilidad: las moléculas orgánicas en el agua eluyente pueden competir con las moléculas de la muestra para vincularse con las perlas de la columna (fase estacionaria). Esto disminuye el número de moléculas de muestra que se vinculan con la columna y, por consiguiente, reduce el número de moléculas liberadas durante el proceso de elución.
(iii) Datos imprecisos: es posible obtener picos fantasma o de contaminantes a partir de los compuestos orgánicos que se acumulan en el cabezal de la columna y luego se recogen como eluyente.
(iv) Cambio en el tiempo de retención : los altos niveles de compuestos orgánicos pueden crear una nueva fase estacionaria en la columna, que puede motivar cambios en el tiempo de retención y colas en los picos. También puede provocar un aumento de la contrapresión.
Por lo tanto, es fundamental controlar con precisión el nivel de sustancias orgánicas en el agua utilizada para aplicaciones de HPLC. El carbono orgánico total (TOC) mide el total de especies orgánicas presentes en el agua. El TOC se mide en unidades de partes por millón (ppm) o partes por billón (ppb). Los orgánicos, presentes en altas ppb, pueden alterar la identificación espectral de los oligocomponentes en la mezcla e influir en la cuantificación de los picos.
Un sistema de HPLC puede verse contaminado por gran variedad de fuentes de TOC. Estas incluyen el agua, filtraciones de los medios de purificación, tubos y recipientes, contaminación bacteriana y, potencialmente, la absorción desde la atmósfera. De hecho, ahora se recomienda evitar el uso de agua embotellada de alta pureza que no esté recién purificada. Esto se debe a que el agua embotellada para HPLC que se ha almacenado en un entorno de laboratorio durante más de 8 horas (exposición a orgánicos atmosféricos) o el agua destilada puede presentar un aumento en los niveles de TOC.
Fig 1: Comparison of the TOC levels in HPLC-grade water and Ultrapure water.
La Figura 1 compara el cromatograma del agua de grado HPLC y el agua ultrapura medida a longitudes de onda de 254 nm y 214 nm. El agua de grado HPLC presenta mayores niveles de TOC, que se filtran desde la columna y provocan cambios en la línea de referencia, con un mayor tamaño y número de picos, en comparación con el agua ultrapura [2].
Por lo tanto, el uso de agua pura es fundamental para los análisis HPLC, y es importante mantener el agua libre de todo tipo de contaminantes. Los cromatógrafos, además de garantizar la pureza de los disolventes orgánicos, los estándares y otros componentes de la fase móvil de HPLC, también deben asegurarse de que el agua usada como reactivo sea de alta calidad y libre de contaminantes.
2. Partículas y coloides
La presencia de partículas y coloides en la muestra de agua puede provocar daños en la bomba y el inyector, además de obstruir físicamente la columna. También pueden comportarse como una fase sólida en la columna que se vincula con los componentes de la muestra. Los coloides también pueden adsorberse irreversiblemente en el material del paquete de la columna y evitar que los componentes de la muestra se vinculen con la columna.
3. Iones
La presencia de iones en el disolvente también puede afectar a las separaciones cromatográficas. La presencia de iones que absorben UV, como nitratos, nitritos, sulfatos, bromuros, cloruros y fluoruros, puede atravesar la columna y aparecer como un pico en el cromatograma, lo que dificulta el análisis de los datos.
Entre los diferentes contaminantes del agua que afectan al análisis HPLC, los orgánicos son con diferencia los determinantes más importantes para la pureza del agua. La evidencia experimental sugiere firmemente que el agua ultrapura recién preparada debe ser la opción para cualquier HPLC, ya que otras fuentes de agua, como el agua destilada o incluso el agua embotellada de grado HPLC, siguen conteniendo cantidades relativamente altas de orgánicos, lo que puede comprometer la calidad de los cromatogramas y el rendimiento del aparato (véase la Figura 1).
Por lo tanto, es esencial garantizar que se utilicen sistemas de depuración de agua de alto nivel y que el propio sistema se mantenga adecuadamente.
Medición del agua
Asegúrese de utilizar el tipo de agua adecuado para su aplicación. Estos son los requisitos para las aplicaciones de cromatografía líquida:
| Sensibilidad necesaria | Resistividad (MΩ.cm)* | TOC (ppb) | Filtro (µm) | Bacterias (CFU/ml) | Endotoxinas (EU/ml) | Nucleasas | Grado del agua |
| Cromatografía iónica | General Alto | >5 18,2 | <50 <10 | <0,2 <0,2 | <10 <1 | N. d. N. d. | N. d. N. d. | Agua de grado general de laboratorio Agua ultrapura (tipo 1) |
| HPLC | General Alto | >1 >18 | <50 <3 | <0,2 <0,2 | <1 <1 | N. d. N. d. | N. d. N. d. | Agua de grado general de laboratorio Agua ultrapura (tipo 1) |
¿Cómo resuelve ELGA Veolia los problemas de pureza del agua para HPLC?
Actualmente existen diferentes sistemas de purificación disponibles y cada método tiene sus propias ventajas y limitaciones. La experiencia de ELGA en sistemas de purificación de agua tiene una larga reputación. ELGA ha clasificado la pureza del agua en diferentes grados, lo que ayuda a determinar el nivel de pureza del agua necesario para una determinada aplicación. Por ejemplo, nuestro sistema PURELAB® Chorus 1 Analytical Research suministra agua ultrapura de tipo I con niveles de TOC desde 2 ppb, muy adecuada para experimentos de HPLC. ELGA ofrece sistemas de purificación de agua que son fáciles de usar, rentables y de bajo mantenimiento.
Conclusiones
La pureza del agua como reactivo de laboratorio es crucial para el éxito de los experimentos. Las tecnologías muy sensibles, como la HPLC, requieren agua de muy alta pureza, lo que significa que el agua utilizada debe tener mínimos niveles de TOC y estar libre de cualquier otro contaminante. El agua ultrapura recién preparada es la mejor elección para los experimentos de HPLC y la amplia gama de sistemas de purificación de agua de ELGA ayuda a los investigadores de todo el mundo a garantizar que el agua utilizada en sus experimentos tenga la pureza deseada.
Referencias:
[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development. Pharm Anal Acta 2012;3. doi:10.4172/2153-2435.1000147.
[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography: A short review. J Glob Pharma Technol 2010;2:22–6.
